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关于《植物蛋白饮料中植物源性成分鉴定》补充检验方法
2017-06-21 15:49:39 来源：国家食品药品监督管理总局
1 范围
本方法规定了核桃源性成分、花生源性成分、杏仁源性成分、芝麻源性成分、榛子源性成分、大豆源性成分鉴定的实时荧光PCR方法。
本方法适用于核桃露（乳）、杏仁露、果仁露等复合植物蛋白饮料中标识含有核桃源性成分、花生源性成分、杏仁源性成分、芝麻源性成分、榛子源性成分、大豆源性成分的检测及鉴定。
2 原理
提取试样中基因组DNA，以DNA为模板，利用物种特异性引物及探针进行实时荧光PCR扩增检测，同时设置阳性、阴性及空白对照。根据扩增的Ct值，判定试样中是否含有该源性成分。
3试剂和材料
除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB 6682的要求。所有试剂均用无
DNA酶污染的容器分装。
3.1核桃源性成分Jugr2基因检测用引物对序列为：
核桃5 端引物：5 -CGCGCAGAGAAAGCAGAG-3
核桃3 端引物：5 -GACTCATGTCTCGACCTAATGCT-3
核桃探针：5 -FAM-TTGTGCCTCTGTTGCTCCTCTTCCC-TAMRA-3
3.2花生源性成分Ara b2基因检测用引物（对）序列为：
花生5 端引物：5 -GCAACAGGAGCAACAGTTCAAG-3
花生3 端引物：5 -CGCTGTGGTGCCCTAAGG-3
花生探针：5 -FAM-AGCTCAGGAACTTGCCTCAACAGTGCG-Eclipse-3
3.3 杏仁源性成分Prudul基因检测用引物（对）序列为：
杏仁5 端引物：5 -TTTGGTTGAAGGAGATGCTC-3
杏仁3 端引物：5 -TAGTTGCTGGTGCTCTTTATG-3
杏仁探针：5 -FAM-TCCATCAGCAGATGCCACCAAC- Eclipse-3
3.4芝麻源性成分2S albumim mRNA基因检测用引物（对）序列为：
芝麻5 端引物：5 -CCAGAGGGCTAGGGACCTTC-3
芝麻3 端引物：5 -CTCGGAATTGGCATTGCTG-3
芝麻探针：5 -FAM-TCGCAGGTGCAACATGCGACC- TAMRA-3
3.5榛子源性成分oleosin基因检测用引物（对）序列为：
榛子5 端引物：5 -CCCCGCTGTTTGTGATAT-3
榛子3 端引物：5 -ATGATAATAAGCGATACTGTGAT-3
榛子探针：5 -FAM-TCCCGTTCTCGTCCCTGCGGT- Eclipse-3
3.6大豆源性成分Lectin基因检测用引物（对）序列为：
大豆5 端引物：5 -GCCCTCTACTCCACCCCCA-3
大豆3 端引物：5 -GCCCATCTGCAAGCCTTTTT-3
大豆探针：5 -FAM-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC- TAMRA-3
3.7真核生物18SrRNA内参照检测用引物（对）序列为：
内参照5 端引物： 5 -TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3
内参照3 端引物： 5 -AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3
内参照探针：5 -FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAAC- TAMRA-3
3.8 CTAB缓冲液：55 mmol/L CTAB，1400mmol/L NaCl，20 mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris，
用10%盐酸调节pH 至8.0，121℃高压灭菌20 min, 备用。
3.9 蛋白酶K：20mg/mL。
3.10苯酚：氯仿：异戊醇（体积比：25:24:1）。
3.11 异丙醇。
3.12 70%乙醇。
3.13 Taq DNA聚合酶。
3.14 dNTP混合液。
3.15 TE缓冲液（Tris-HCl、EDTA缓冲液）：10mmol/L Tris-HCl（pH8.0），1 mmol/L EDTA（pH8.0）。
3.16 10 PCR缓冲液：200 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl2，200 mmol/L Tris-HCl（pH8.8）。
4仪器和设备
4.1 组织研磨器。
4.2 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。
4.3 恒温水浴锅。
4.4 离心机：离心力12,000g。
4.5 微量移液器（0.5 L~10 L，10 L~100 L，10 L~200 L，100 L~1000 L）。
4.6 实时荧光PCR仪。
4.7 涡旋振荡器。
4.8 天平：感量0.01g。
5分析步骤
5.1 试样总DNA的提取
固体样品：将样品粉碎后称取0.3~0.6 g，按下列方法提取DNA。也可用等效商品化DNA提取试剂盒提取DNA。
液体样品：取1 mL 样品于Eppordorf管中，加入1 倍体积的异丙醇，混合均匀，室温下沉淀5 min，室温下以12,500 rpm 离心5 min，弃去上清液。重复此操作一次。所得的沉淀用于提取DNA。可按下列方法提取DNA，也可用等效商品化DNA提取试剂盒提取DNA。
（1）将处理后的样品加入2 mL离心管中，加入600 L CTAB缓冲液和40 L蛋白酶K溶液，振荡混匀，65℃孵育1 h（过夜孵育更好）， 期间每隔10 min振荡混匀；
（2）加入500 L的苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），振荡抽提10 min，室温下以12,500 rpm 离心10 min；
（3）小心吸取上清液，加入等体积的异丙醇，振荡均匀，12,500 rpm 离心10 min；
（4）弃去上清液，用65℃预热的TE缓冲液溶解DNA；
（5）小心吸取上清，加入200 L氯仿：异戊醇（24:1），振荡抽提，室温下以12500 rpm 离心15 min；
（6）小心吸取上清液，加入等体积的异丙醇，振荡均匀，12,500rpm 离心10 min；
（7）弃去上清液，沉淀用70% 乙醇洗涤，离心1min，晾干，溶于50 LTE 缓冲液中。
5.2 DNA浓度和纯度的测定
取1 L DNA溶液，使用核酸蛋白分析仪检测其浓度及质量，OD260/280值应在1.7~1.9之间时，适宜于PCR扩增。
5.3 实时荧光PCR扩增
反应体系总体积为25 L，其中10 PCR缓冲液5 L，正反向引物（10 mol/L）各1 L，探针（10 mol/L）1 L，dNTPs（10 mol/L）2 L ，Taq DNA聚合酶（2.5U）0.2 L，DNA模板（10-100ng/ L）2 L，用灭菌去离子水补足至总体积25 L。真核生物内参照的反应体系同上，仅替换相应的引物和探针。也可使用相应的商品化扩增试剂盒。
反应参数：50℃ 2min； 95℃ 15min； 95℃ 15s， 60℃ 1min， 40个循环。
5.4 实验对照
检验过程分别设阳性对照、阴性对照、空白对照。以相应植物源物种提取的DNA为阳性对照，以已知不含该植物源的物种DNA为阴性对照，以灭菌水为空白对照。样品、内参照和对照设置两个平行的反应体系。
6结果判断与表述
6.1 质量控制
以下条件有一条不满足时，结果视为无效：
（a）空白对照：无FAM荧光信号检出；
（b）阴性对照：无FAM荧光信号检出；
（c）阳性对照：有FAM荧光信号检出，且FAM通道出现典型的扩增曲线，Ct值 35.0；
（d）内参对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值＜30.0。
6.2 结果判定
（a）如Ct值 35.0，则判定为被检样品阳性；
（b）如Ct值 40.0，则判定为被检样品阴性；
（c）如35.0＜Ct值＜40.0，则重复试验一次。如再次扩增后Ct值仍为35.0＜Ct值＜40.0，则判定被检样品可疑。
6.3 结果表述
结果为阳性者，结合产品标识，表述为 检出XX源性成分 。
结果为阴性者，结合产品标识，表述为 未检出XX源性成分 。
结果为可疑者，结合产品标识，表述为 XX源性成分可疑 。
7防污染措施
检测过程中放置交叉污染的措施按照GB/T 27403中的规定执行。
本方法负责起草单位：河北省检验研究院。
验证单位：食品药品检验研究院、北京市食品安全监控和风险评估中心、湖北省食品质量安全监督检验研究院、武汉食品化妆品检验所、河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心、肉类食品综合研究中心。
主要起草人：周巍、王爽、章晶晶、崔生辉、李永波、孙勇。